最近构建了5个新基因的质粒，都成功了。 从研一都现在至少做过20多个质粒了，过表达，敲低，突变，截断都做过… 个人感觉野生型和sg是相对来说有难度的，突变体质粒是最简单的，今天分享一些个人构建野生型plasmid的小经验和小技巧，码住吧各位，肯定对你们有帮助的。[派对R] 1、订引物：前后引物TM值相差不宜过大，最好在3度之内。之前分享过质粒构建的引物设计详细教程，这里不赘述了，不会的区翻前面的笔记。 2、PCR：拿到引物后先计算TM值，前引物加后引物再除以2，如果TM值差别较大，参考前后引物中比较小的那个值，以算出来的理论TM值为中心，各加减2度，做温度梯度先少量pcr。 3、PCR后琼脂糖验证：跑凝胶看条带亮度（如1图所示），选择条带最亮的那个温度大量P，一般p 100ul就够了。（图2，条带单一，亮即可） 4、纯化回收：大量p完后纯化回收pcr产物，或者切胶回收。这里回收肯定会损失，单一峰，浓度20+都可以用，浓度低点没事。 5、双酶切：pcr产物和载体一起切，根据说明书做就可以，pcr产物浓度低的话酶切完就别回收！！！！直接验证连接。 6、酶切后验证：个人这里只验证载体是否切开，只要载体切开了，pcr产物肯定也切开了。 跑胶：未切开的载体环状跑得快并且会拖尾；切开的线性载体跑的慢不会拖尾。（图3） 7、连接：用T4连接酶，连接时间久一些，说明书写的10min，我一般连接30min以上。 8、做转化：把连接产物全部做转化，用50ul感受态，做完转化后+100ul 无抗性LB，37度摇1小时以上，充分激活感受态，摇完之后涂板。 9、涂板：所有的转化产物全涂！！！成功率会高很多。（可以瞬离一下涂沉淀），新构建的质粒会长得慢，37度培养箱放12个小时+，等菌长大的时候再挑单克隆。（图4） 10、摇菌：挑单克隆小摇，个人每个板子挑3～5颗菌，全部送去测序。 ⚠️摇菌注意：用10ul小枪头挑，直接把枪头打进管里，37度摇床摇菌时，把离心管盖拧松斜着插。 一方面让大量空气进去，斜着插增加大肠杆菌和空气的接触面积，另一方面防止管子钓掉摇床下面。